Gebrûk en foarsoarchsmaatregels fan ultrafiltration centrifuge tube
1) Kies in gaadlike ultrafiltraasjebuis.Tink derom dat UF-membranen ferskille yn har nivo fan tolerânsje foar ferskate gemikaliën.Typysk kinne ultrafiltraasjebuizen mei in 10 kDa molekulêre gewicht cut-off wurde selekteare mei in molekulêre gewicht cut-off dy't net grutter wêze moat as 1/3 fan it molekulêre gewicht fan it proteïne fan belang, lykas 35 kDa.As it molekulêre gewicht fan it proteïne fan belang is om 10 kd, kin in ultrafiltraasje buis mei in molekulêre gewicht cut-off fan 3 KD brûkt wurde.
(2) De ultrafiltraasje, freshly kocht, is droech, mei ultrapure wetter tafoege foar gebrûk en wetter folslein troch it membraan, iisbad of kuolkast foar in pear minuten foarôfkuolle.It wetter wurdt dan ôfgetten, dus de proteïneflüssigens, en hoefolle der bykomt, wat net mear is as de wite line boppe yn de buis.De operaasje is ljocht, en de ultrafiltraasjebuis moat foargekoeld wurde op iis foardat de proteïne-oplossing tafoege wurdt.
3) Sawol de massa as it swiertepunt soene it lykwicht berikke.Tink derom dat de rotaasjesnelheid en fersnelling net heul fluch binne, oars direkte skea oan it ultrafiltraasjemembraan.Sentrifugale ultrafiltraasje waard begûn (sintrifuge foargekoeld oant 4 graden).Neidat de RPM fan ferskillende centrifuges waard omboud ta g, it wie oars.De fersnelling fan 'e sintrifuge waard oanpast oan in minimum, wêrtroch't de druk op it membraan fermindere.Tink derom, wês wis dat jo de centrifuge ferlitte nei't de centrifuge syn bestimmingssnelheid hat berikt, of as jo in probleem hawwe, kinne jo it net foar it earst behannelje.De oriïntaasje fan it membraan nei de spil waard oanpast neffens de ynstruksjes (angular centrifuge gefal is membraan nei as loodrecht).Yn praktysk gebrûk is de algemiene rotaasjesnelheid leger as dy yn 'e ynstruksjes, sadat it libben fan' e sintrifugebuis ferlingd wurde kin.
3) Sawol de massa as it swiertepunt soene it lykwicht berikke.Tink derom dat de rotaasjesnelheid en fersnelling net heul fluch binne, oars direkte skea oan it ultrafiltraasjemembraan.Sentrifugale ultrafiltraasje waard begûn (sintrifuge foargekoeld oant 4 graden).Neidat de RPM fan ferskillende centrifuges waard omboud ta g, it wie oars.De fersnelling fan 'e sintrifuge waard oanpast oan in minimum, wêrtroch't de druk op it membraan fermindere.Tink derom, wês wis dat jo de centrifuge ferlitte nei't de centrifuge syn bestimmingssnelheid hat berikt, of as jo in probleem hawwe, kinne jo it net foar it earst behannelje.De oriïntaasje fan it membraan nei de spil waard oanpast neffens de ynstruksjes (angular centrifuge gefal is membraan nei as loodrecht).Yn praktysk gebrûk is de algemiene rotaasjesnelheid leger as dy yn 'e ynstruksjes, sadat it libben fan' e sintrifugebuis ferlingd wurde kin.
(4) As konsintrearre nei de oerbleaune 1ml, nim dan 50ul fan bufferoplossing, foegje 10ul fan stream troch en sjoch as der in blauwe kleur is, as oardiel oft de ultrafiltraasjebuis proteïne mist.As de buis is leaky, re pour de boppeste laach en flowthrough yn in nije buis te begjinnen ultrafiltration.Om krekt te bepalen as buizen mist binne, sintrifuge foar 10 minuten mei 5mgml BSA foarôfgeand oan trochstreaming, rinnend op proteïnelijm, as Bradford crude assay, en trochgean troch it tafoegjen fan de oerbleaune konsintrearre proteïne-oplossing (dy't wurket op iis en foarkomt dat proteïnen ferwaarmje) oant al it konsintraat is tafoege.Wês foarsichtich by sintrifugering as delslach fan aaiwiten optreedt, wat liedt ta buissluting.As delslach optreedt, bepale oft de spesifike oarsaak fan delslach is in oerstallige protein konsintraasje of in ûnskiklik buffer;De earste kin oplost wurde troch ultrafiltraasje fan meardere ultrafiltraasjebuizen tagelyk, it ferminderjen fan de konsintraasje, en de lêste troch it wikseljen fan ferskate bufferoplossingen oant gjin delslach fan it aaiwyt opkomt.
(4) As konsintrearre nei de oerbleaune 1ml, nim dan 50ul fan bufferoplossing, foegje 10ul fan stream troch en sjoch as der in blauwe kleur is, as oardiel oft de ultrafiltraasjebuis proteïne mist.As de buis is leaky, re pour de boppeste laach en flowthrough yn in nije buis te begjinnen ultrafiltration.Om krekt te bepalen as buizen mist binne, sintrifuge foar 10 minuten mei 5mgml BSA foarôfgeand oan trochstreaming, rinnend op proteïnelijm, as Bradford crude assay, en trochgean troch it tafoegjen fan de oerbleaune konsintrearre proteïne-oplossing (dy't wurket op iis en foarkomt dat proteïnen ferwaarmje) oant al it konsintraat is tafoege.Wês foarsichtich by sintrifugering as delslach fan aaiwiten optreedt, wat liedt ta buissluting.As delslach optreedt, bepale oft de spesifike oarsaak fan delslach is in oerstallige protein konsintraasje of in ûnskiklik buffer;De earste kin oplost wurde troch ultrafiltraasje fan meardere ultrafiltraasjebuizen tagelyk, it ferminderjen fan de konsintraasje, en de lêste troch it wikseljen fan ferskate bufferoplossingen oant gjin delslach fan it aaiwyt opkomt.
(5) De earste pear stappen wurde brûkt om konsintrearje it aaiwyt, en as de buffer is te feroarjen, sêft foegjen nije buffer (ultrafiltration troch in 0.22um ultrafiltration membraan) oan likernôch 1ml fan it totale aaiwyt, en reconcentrate nei likernôch 1ml foar trije opienfolgjende kear, mei de úteinlike konsintrearre finale folume ôfhinklik fan de winske protein konsintraasje, algemien net mear as 500ul, mar ek oan binnen 200ul.Berikke 1000 × of mear by trije gelegenheden, yn essinsje safolle bufferferoaring, lykas berekkene troch op syn minst 10 × of sa folumeferriking elke kear.
(5) De earste pear stappen wurde brûkt om konsintrearje it aaiwyt, en as de buffer is te feroarjen, sêft foegjen nije buffer (ultrafiltration troch in 0.22um ultrafiltration membraan) oan likernôch 1ml fan it totale aaiwyt, en reconcentrate nei likernôch 1ml foar trije opienfolgjende kear, mei de úteinlike konsintrearre finale folume ôfhinklik fan de winske protein konsintraasje, algemien net mear as 500ul, mar ek oan binnen 200ul.Berikke 1000 × of mear by trije gelegenheden, yn essinsje safolle bufferferoaring, lykas berekkene troch op syn minst 10 × of sa folumeferriking elke kear.
Post tiid: Nov-09-2022