PCR, is de polymerase-kettingreaksje, dy't ferwiist nei de tafoeging fan dNTP, Mg2+, elongaasjefaktoaren en fersterkingsfaktoaren oan it systeem ûnder de katalyse fan DNA-polymerase, mei it âlder DNA as sjabloan en spesifike primers as útgongspunt fan útwreiding, Troch de stappen fan denaturaasje, annealing, útwreiding, ensfh., It proses fan in vitro replikearjen fan dochterstreng DNA komplemintêr oan 'e âlderstreng template DNA kin elk doel DNA in vitro fluch en spesifyk fersterkje.
1. Hot Start PCR
De starttiid fan amplifikaasje yn konvinsjonele PCR is net om de PCR-masine yn 'e PCR-masine te setten, en dan begjint it programma te fersterkjen.As de systeemkonfiguraasje foltôge is, begjint de amplifikaasje, wat net-spesifike fersterking kin feroarsaakje, en hot-start PCR kin dit probleem oplosse.
Wat is hot start PCR?Nei't it reaksjesysteem is taret, wurdt de enzymmodifier frijlitten by hege temperatuer (meastentiids heger as 90 ° C) yn 'e earste ferwaarmingsfaze fan' e reaksje of "hot start" -poadium, sadat de DNA-polymerase wurdt aktivearre.De krekte aktivearring tiid en temperatuer hinget ôf fan 'e aard fan' e DNA polymerase en de hot-start modifier.Dizze metoade brûkt benammen modifiers lykas antykladen, affiniteitsliganden, as gemyske modifiers om de aktiviteit fan DNA-polymerase te remmen.Sûnt de aktiviteit fan DNA-polymerase wurdt ynhibeare by keamertemperatuer, biedt hot-starttechnology grut gemak foar it tarieden fan meardere PCR-reaksjesystemen by keamertemperatuer sûnder de spesifisiteit fan PCR-reaksjes op te offerjen.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) is in eksperimintele technyk foar reverse transkripsje fan mRNA nei cDNA en it te brûken as sjabloan foar amplifikaasje.De eksperimintele proseduere is om earst totaal RNA yn weefsels as sellen te ekstrahearjen, Oligo (dT) as primer te brûken, reverse transkriptase te brûken om cDNA te synthesisearjen, en dan cDNA te brûken as sjabloan foar PCR-amplifikaasje om it doelgen te krijen of geneekspresje te detektearjen.
3. Fluorescent kwantitative PCR
Fluorescent kwantitative PCR (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) ferwiist nei de metoade foar it tafoegjen fan fluorescentgroepen oan it PCR-reaksjesysteem, mei help fan de accumulation fan fluorescent sinjalen om it hiele PCR-proses yn echt tiid te kontrolearjen, en úteinlik de standertkromme te brûken om it sjabloan kwantitatyf te analysearjen.Faak brûkte qPCR-metoaden omfetsje SYBR Green I en TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR ferwiist nei it gebrûk fan twa sets fan PCR-primers foar twa rûnen fan PCR-amplifikaasje, en it amplifikaasjeprodukt fan 'e twadde ronde is it doelgenfragmint.
As in mismatch fan it earste pear primers (bûtenprimers) feroarsaket dat in net-spesifyk produkt wurdt fersterke, is de mooglikheid dat deselde net-spesifike regio wurdt werkend troch it twadde pear primers en bliuwt te fersterkjen tige lyts, dus de amplifikaasje troch it twadde pear primers, de spesifisiteit fan PCR is ferbettere.Ien foardiel fan it útfieren fan twa rûnen fan PCR is dat it helpt om genôch produkt te fersterkjen fan beheind startend DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR is in metoade om de spesifisiteit fan PCR-reaksje te ferbetterjen troch de parameters fan 'e PCR-syklus oan te passen.
Yn touchdown PCR wurdt de annealing temperatuer foar de earste pear syklusen ynsteld in pear graden boppe de maksimale annealing temperatuer (Tm) fan de primers.Hegere annealing temperatuer kin effektyf ferminderjen net-spesifike amplification, mar tagelyk, hegere annealing temperatuer sil aggravate de skieding fan primers en doel sekwinsjes, resultearret yn fermindere PCR opbringst.Dêrom, yn 'e earste pear syklusen, de annealing temperatuer wurdt meastal ynsteld om ôfnimme troch 1 ° C per syklus te fergrutsjen de ynhâld fan it doelgenen yn it systeem.As de annealing temperatuer wurdt ferlege nei de optimale temperatuer, de annealing temperatuer wurdt hanthavene foar de oerbleaune syklussen.
6. Direkte PCR
Direkte PCR ferwiist nei de amplifikaasje fan doel-DNA direkt út it stekproef sûnder de needsaak foar isolaasje en suvering fan nukleïnesûr.
D'r binne twa soarten direkte PCR:
direkte metoade: nim in lyts bedrach fan stekproef en heakje it direkt oan PCR Master Mix foar PCR identifikaasje;
cracking metoade: nei in sampling fan de stekproef, heakje it oan de lysate, lyser foar in release genoom, nim in lyts bedrach fan lysed supernatant en heakje it oan PCR Master Mix, útfiere PCR identifikaasje.Dizze oanpak ferienfâldiget de eksperimintele workflow, ferminderet de praktyske tiid en foarkomt DNA-ferlies tidens suveringsstappen.
7. SOE PCR
Gen-splitsing troch oerlap-útwreiding PCR (SOE PCR) brûkt primers mei komplementêre úteinen om PCR-produkten te meitsjen foarmje oerlappende keatlingen, sadat yn 'e folgjende amplifikaasjereaksje, troch de útwreiding fan' e oerlappende keatlingen, ferskate boarnen fan A-technyk wêryn fersterke fragminten oerlappe wurde en mei-elkoar slein.Dizze technology hat op it stuit twa haadtapassingsrjochtingen: konstruksje fan fúzjegenen;gene site-rjochte mutaasje.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) brûkt omkearde komplementêre primers om DNA-fragminten oars as de twa primers te fersterkjen, en fersterket ûnbekende sekwinsjes oan beide kanten fan in bekend DNA-fragmint.
IPCR waard oarspronklik ûntworpen om de folchoarder fan neistlizzende ûnbekende regio's te bepalen, en wurdt meast brûkt om genpromotorsekwinsjes te studearjen;onkogene chromosomale weryndielingen, lykas genfúzje, translokaasje en transposysje;en virale gen-yntegraasje, wurde no ek faak brûkt Foar site-rjochte mutagenese, kopiearje in plasmide mei de winske mutaasje.
9. dPCR
Digitale PCR (dPCR) is in technyk foar de absolute kwantifikaasje fan nukleïnesûrmolekulen.
D'r binne op it stuit trije metoaden foar de kwantifikaasje fan nukleïnesûrmolekulen.Photometry is basearre op de absorption fan nucleic acid molekulen;real-time fluorescent kwantitative PCR (Real Time PCR) is basearre op de Ct wearde, en de Ct wearde ferwiist nei it syklus nûmer oerienkomt mei de fluorescence wearde dat kin wurde ûntdutsen;digitale PCR is de lêste kwantitative technology basearre op single-molecule PCR metoade foar tellen nucleic acid kwantifikaasje is in absolute kwantitative metoade.
Post tiid: Jun-13-2023